阿尔茨海默病（ Alzheimer disease ， AD ）是一种与衰老闭联的渐进性中枢神经编造退行性疾病，闭键临床显露为实行性认知功效困穷、研习回顾才力减退、常日生存才力渐渐损失等。其楷模病理特质为神经元之间 β 淀粉样卵白（ amyloid β-protein ， Aβ ）浸积变成暮年斑、神经元内 Tau 卵白太过磷酸化变成神经原纤维缠结（ neurofibrillary tangle ， NFT ），以及由此激发的充满性炎性坏死病灶和神经元豪爽物化。目前闭于 AD 的发病机造尚未知晓，但 Aβ 纠合被公以为是其重点绪造，拥有神经毒性的 Aβ42 纠合变成不溶性淀粉样斑块，激活胶质细胞发作神经毒性介质和炎症因子，进而促使神经细胞内斑块变成，最终损害个人神经元 [1-5] 。其它，慢性炎症性疾病如动脉粥样硬化、肥胖 / 代谢归纳征、 2 型糖尿病和重度抑郁等都是 AD 产生生长的紧张身分 [6] 。 AD 的发病机造绝顶杂乱，目前对其领悟还很限造，所以从分别角度展开对 AD 发病机造和调理的考虑已成为本范畴的热门。
中医学以为心藏神、肝藏魂、脾藏意、肾藏精， AD 与五脏中央、肝、脾、肾的功效失调亲切闭联，所以中医临床上常以养心安神、补肾填精、益气健脾、平肝开窍来调理 AD[7-8] 。酸枣仁有养肝宁心、安神生津的效率，是《中国药典》收载的调理失眠最常用的单味中药。考虑标明， AD 患者中有 25% ～ 40% 伴有睡眠布局更改 [9] ，睡眠困穷可加快 Aβ 浸积，影响脑内微境况，作梗海马神经干细胞活性而遏抑神经再生，从而加重 AD 的病理过程 [10-12] 。酸枣仁皂苷 A （ jujuboside A ， JuA ）是酸枣仁 Ziziphi Spinosae Semen 中含量最高的一种皂苷因素，除拥有从容催眠、抗恐慌、抗抑郁等影响表，又有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神经维持等多种生物活性 [13] 。本课题组前期考虑及他人考虑均已觉察， JuA 可遏抑 AD 幼鼠脑内炎症响应与氧化应激毁伤，推动 Aβ 排除树胶，减轻脑机闭毁伤 [14-15] ，并激活内源神经干细胞推动海马神经再生 [16] 。以上考虑标明 JuA 具备调理 AD 的潜力，但其闭联影响机造尚不万分知晓。本考虑以淀粉样前体卵白（ amyloid precursor protein ， APP ） / 早老卵白 1 （ pesenilin 1 ， PS1 ）双转基因幼鼠动作 AD 模子，采用转录组学测序（ transcriptome sequencing ， RNA-Seq ）技艺连系生物音信学手法，剖析 JuA 调理 AD 的潜正在靶基因及闭联信号通道，并予以实行验证，以阐明 JuA 调理 AD 的分子机造。
JuA （质地分数为 99.78% ，批号 22032904 ）购自成都普菲德生物科技有限公司；盐酸多奈哌齐片（安理申，国药准字 H20050978 ，批号 2203026 ）由卫材（中国）药业有限公司临盆；尼氏（ Nissl ）染色液（批号 C0117 ）购自碧云先天物技艺考虑所；苏木素 - 伊红（ HE ）染色试剂盒（批号 D006-1-2 ）购自南京修成生物工程考虑所；机闭冰冻切片 OCT 包埋剂（批号 4583 ）购自美国 Sakura 公司； TRIzol 试剂（批号 T101100 ）购自上海美吉生物医药科技有限公司公司；三氯甲烷（批号 0706106 ）购自上海申博化工有限公司；异丙醇（批号 20170901 ）购自天津市风船化学试剂科技有限公司； RNA 逆转录试剂盒（批号 G592 ）购自英国 Abcam 公司； qRT-PCR 检测试剂盒（批号 31598800 ）购自瑞士 Roche 公司； RNA 6000 Nano kit 检测试剂盒（批号 5067-1511 ）购自美国 Agilent 公司；葡萄糖激酶（ glucokinase ， Gck ）抗体（批号 sc-17819 ）购自圣克鲁斯生物技艺有限公司； HRP 标志的山羊抗兔 IgG 二抗（批号 bs-40295G-HRP ）购自北京博奥森生物技艺有限公司； GAPDH 抗体（批号 WL01114 ）购自万类生物科技有限公司。
APP/PS1 双转基因幼鼠 50 只，按体质地随机分为模子组及 JuA 低、中、高剂量组和盐酸多奈哌齐组，每组 10 只；另取野生型 C57BL/6 幼鼠 10 只动作比较组。凭借文件报道 [13,17] 和本课题组前期考虑结果，将 JuA 的给药剂量确定为 5 、 10 、 20 mg/kg （ ip 给药）， 1 次 /d ，接连 21 d ；模子组和比较组 ip 等体积心理盐水；多奈哌齐组按人与幼鼠等效剂量换算为 0.65 mg/kg （ ig 给药）， 1 次 /d ，接连 21 d 。
接连给药 21 d 后，采用 Morris 水迷宫实行检测各组幼鼠的研习回顾才力。前 5 d 为定位航行实行，第 6 天为空间查究实行。 ① 定向航行实行：将幼鼠随机面朝池壁放入水中，其拍浮轨迹图由拍摄编造自愿搜罗、剖析，将拍浮旅程和找到平台并正在其上停顿 15 s 所需时刻界说为逃避埋伏期，每天以 4 次操练中埋伏期的均匀值动作当日功效，评估幼鼠的研习才力； ② 空间查究实行：第 6 天撤去平台，选拔原平台的对侧动作入水点，记载幼鼠正在 60 s 内穿越原平台的次数、正在原平台所正在象限停即刻刻百分比登第 1 次穿越平台前的拍浮间隔，评估幼鼠的回顾才力。
水迷宫实行已毕后，幼鼠 ip 4% 水合氯醛麻醉，心脏灌流后取脑，冰冻包埋、 − 80 ℃速冻，用冰冻切片实行接连冠状切片（ 10 μm ）。将脑切片用 4% 多聚甲醛固定 10 min 后，放入 Nissl 染液中，待尼氏体分明后终止响应；再依序经 70% 、 100% 乙醇脱水 30 s ，二甲苯透化 5 min ，中性树胶封片，显微镜下窥察皮层、海马尼氏体的数目。
将脑片用 4% 多聚甲醛固定 10 min 后，置于 50 ℃的苏木素中 5 min ，流水洗去残剩液体后置于瓦解液中 10 ～ 20 s ，用润洗 2 次；放入 0.5% 氨水中反蓝 10 s ， ddH2O 再次润洗；放入伊红染液中 3 ～ 5 s ， ddH2O 润洗 2 次；用分别浓度乙醇实行梯度脱水后，二甲苯透化 5 min ，中性树脂胶封片，正在显微镜下窥察皮层和海马机闭样子改变。
取比较组、模子组与 JuA 高剂量组幼鼠各 3 只，切取脑内海马机闭，委托上海派森诺生物科技有限公司实行 RNA 提取与 RNA-Seq 测序。将脑机亲热成幼块，用 TRIzol 裂解液低温提取总 RNA ，质检及格后通过带有 Oligo （ dT ）的磁珠富集拥有 polyA 的 mRNA ，以片断化的 mRNA 为模板合成双链 cDNA ，随后对 cDNA 实行末尾修复、加 A 尾并贯串测序接头；通过 AMPure XP beads 筛选 cDNA ， PCR 扩增后，再对 PCR 产品实行纯化打点，最终得到 cDNA 文库。采用 Illumina HiSeq 6000 型测序仪实行测序剖析 [18-19] 。
对转录组测序的原始数据（ raw data ）实行过滤，筛选获得高质地数据音信；用 DESeq v1.20.0 软件考虑各组之间的区别表达基因，将前提配置为区别倍数 log2FC ＞ 1 ，明显性 P ＜ 0.05 BOB半岛，对 9 个样品的 mRNA 实行区别表达基因的筛选。为了担任区别基因所出席的生物学历程、分子功效和细胞组分，运用 GO 数据库对所得到基因实行富集剖析；再用 KEGG 实行代谢通道的富集剖析，从而获取环节通道音信，并通过 R 言语将闭联音信实行可视化剖析 [18-19] 。
用 TRIzol 提取海马机闭总 RNA ，检测其浓度和完善性后按试剂盒阐述逆转录成 cDNA ，以 GAPDH 为内参基因，定量检测方针基因表达水准。引物序列见表 1 。 PCR 响应前提： 95 ℃、 3 min ， 95 ℃、 15 s ， 60 ℃、 1 min ， 40 个轮回；响应完毕运用 2−ΔΔCt 法谋划基因的相对表达量，以对筛选出的环节基因表达境况实行验证。
提取各组幼鼠海马机闭总卵白，采用 BCA 法测定卵白浓度；将待测卵白液上样到 10% SDS-PAGE 凝胶电泳进步行离散，然后迁徙至 PVDF 膜上，用 5% 脱脂牛奶关闭 2 h 后BOB半岛，参与 Gck 一抗， 4 ℃孵育歇宿；越日，用 TBST 洗膜 3 次，每次 15 min ，孵育二抗， TBST 洗膜 3 次，每次 15 min ， ECL 化学发光试剂盒显色，凝胶成像仪影相，用 Image J 软件剖析图像灰度值，以 GAPDH 动作内参，谋划相应卵白表达量。
用 GraphPad Prism 5.0 软件实行数据剖析，水迷宫实行中的逃避埋伏期数据采用反复丈量双身分方差剖析（ Two-way ANOVA ）；多组间比力采用只身分方差剖析（ One-way ANOVA ），两组间比力采用双尾学生查验（ Two-tailed Students’ test ）。细胞计数采用 Image J 软件定量剖析。
定位航行实行结果标明（图 1-A 、 B ），通过操练后各组幼鼠的逃避埋伏期呈每日降低趋向。与比较组比力，模子组幼鼠从第 2 天起逃避埋伏期显着拉长（ P ＜ 0.01 ）；经低、中、高 3 个剂量组的 JuA 调理后，逃避埋伏期均有分别水平缩短（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），且随给药剂量的增大影响渐渐巩固，个中高剂量组的影响与阳性比较药多奈哌齐组邻近。空间查究实行结果显示（图 1-C ～ F ），各组幼鼠拍浮速率无显着区别；与比较组比力，模子组幼鼠来到原有平台的拍浮间隔显着填补（ P ＜ 0.01 ），穿越平台次数和正在倾向象限停即刻刻百分比均明显低落（ P ＜ 0.01 ），阐述模子组幼鼠回顾才力显着降低；与模子组比力， JuA 各剂量组幼鼠来到原平台的拍浮间隔均显着缩短（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），穿越平台次数和停顿正在倾向象限时刻百分比显着增加（ P ＜ 0.01 ）BOB半岛，个中 JuA 高剂量构成绩最佳。以上结果标明， JuA 能明显改进 AD 幼鼠的研习和回顾才力，其高剂量组影响最佳。
将幼鼠脑切片实行 HE 染色后，置于显微镜下窥察剖析。如图 2 所示，比较组皮层、海马 CA3 和 DG 区的神经细胞方针分明、摆列齐整、数目多；模子组神经细胞摆列疏松、数目删除、样子不正派，细胞核皱缩显着，提示模子组神经细胞显着受损；而与模子组比力， JuA 高剂量组神经细胞方针较为分明，数目增加，胞质丰盛，胞核平均，细胞核固缩显着减轻，阐述 JuA 调理后显着减轻了 AD 幼鼠脑机闭的病理毁伤。
Nissl 染色结果显示，模子组幼鼠皮层、海马区的尼氏体数目均较比较组显着删除（ P ＜ 0.01 ）；而 JuA 高剂量组幼鼠的上述区域尼氏体数目明显多于模子组（ P ＜ 0.01 ），阐述 JuA 对 AD 幼鼠的脑机闭拥有显着维持影响，明显减轻了 AD 病变对脑内神经元的毁伤。
3.3.1 测序数据质地评估 正在所竖立的测序文库中， 9 组样本碱基质地高出 Q 20 的比例正在 98.13% 以上，高出 Q 30 的比例正在 94.64% 以上（表 2 ），标明测序结果较好。
3.3.2 区别表达基因剖析 用 DESeq v1.20.0 软件对 RNA-Seq 获得的基因数据实行区别表达剖析，以 log2FC ＞ 1 、 P ＜ 0.05 为前提实行筛选。结果显示，与比较组比力，模子组有 341 个区别表达基因，个中上调 218 个，下调 123 个；与模子组比力， JuA 高剂量组中区别表达基因共有 94 个，个中上调 66 个，下调 28 个（图 3 ）。进一步剖析觉察，模子组的 5 个区别基因正在 JuA 干涉后表达趋向被逆转（表 3 ），包罗 Gck 、白细胞介素 -1 受体联系激酶 3 （ interleukin-1 receptor associated kinase 3 ， Irak3 ）、间皮素（ mesothelin ， Msln ）、人角卵白（ human keratin ， krt80 ）等基因，阐述 JuA 调理 AD 的机造与调控这些基因表达相闭。个中 Gck 是葡萄糖代谢的环节限速酶，其基因突变可惹起 2 型糖尿病，从而填补 AD 的患病危险或加重 AD 病理起色。本结果显示 JuA 可逆转 AD 幼鼠 Gck 的低落趋向，使其表达显着升高（ P ＜ 0.05 ），提示干涉葡萄糖代谢可以是 JuA 调理 AD 的苛重机造之一。
为进一步真切 AD 病变及 JuA 调理 AD 所涉及基因的生物学功效改变，本考虑对模子组相较于比较组选出的 341 个区别基因、 JuA 高剂量组相较于模子组的 94 个区别基因实行 GO 功效富集剖析，闭键包罗生物学历程（ biological process ， BP ）、细胞组分（ cellular component BOB半岛， CC ）和分子功效（ molecular function ， MF ）富集剖析，并配置 P ＜ 0.05 为筛选圭臬。结果显示，模子组 vs 比较组的区别基因功效闭键聚会正在细胞渗出医治、离子通道、渗出颗粒、肽激素连系与受体活性等（图 4 ）；而 JuA 高剂量组 vs 模子组的区别基因功效闭键富集正在离子转运、细胞骨架与胞质膜、核受体活性等方面（图 5 ）。
运用 KEGG 数据库对模子组 vs 比较组、 JuA 高剂量组 vs 模子组的区别表达基因实行功效诠释分类、通道富集剖析，配置 P ＜ 0.05 为筛选圭臬，以基因比率（ gene ratio ）实行排序。如图 6 所示，模 型组 vs 比较组的341 个区别表达基因闭键富集的途径有钙离子信号通道、环磷酸腺苷（cyclic adenosine 3 ′ ,5 ′-monophosphate ，cAMP ）信号通道、2 型糖尿病等，阐述以上通道与AD 发病亲切闭联；对JuA 高剂量组vs 模子组的94 个区别基因实行富集剖析，觉察闭键涉及2 型糖尿病BOB半岛基于转录组学研究酸枣仁皂苷A刷新阿尔茨海默病幼鼠认知功用打击的机造、细胞黏附因子、白细胞介素-17 （interleukin-17 ，IL-17 ）信号通道和转化滋长因子-β （transforming growth factor-β ，TGF-β ）信号通道上，阐述JuA 的抗AD 影响可以与调控糖尿病和炎症闭联通道相闭。
再以模子组 vs 比较组、 JuA 高剂量组 vs 模子组协同医治的信号通道实行比对剖析，共筛选出 88 条通道，以基因比率（ gene Ratio ）实行排序，对排名前 10 的通道实行重点富集基因剖析。结果显示，与 JuA 调理 AD 闭联性最高的通道是催乳素信号通道、青少年成熟期糖尿病、脂肪消化摄取、 2 型糖尿病、细胞黏附因子、 IL-17 信号通道、 TGF-β 信号通道等。脂肪与糖代谢的庞杂、炎症免疫响应等恰是 AD 产生生长的紧张身分 [6] ， JuA 可通过干涉这些紧张身分防治 AD 。正在这些信号通道中 Gck 基因高频闪现（表 4 ）， JuA 逆转了模子组 Gck 的低落，使其表达显着升高（表 3 ），提示上调 Gck 活性撑持葡萄糖稳态，可以是 JuA 阐明抗 AD 影响的苛重机造之一。
为进一步验证上述筛选结果，采用 qRT-PCR 与Western blotting 对幼鼠脑内Gck 基因与卵白表达水准实行实行验证。如图7 所示，与比较组比力，模子组幼鼠脑内Gck mRNA 和卵白表达水准均显着低落（P ＜0.01 ）；与模子组比力，JuA 高剂量组Gck mRNA 和卵白表达水准均明显升高（P ＜0.05 ），与RNA-Seq 剖析结果划一，阐述JuA 调理AD 的机造与上调Gck 基因与卵白的表达相闭。
本实行采用的 APP/PS-1 双转基因幼鼠，表达嵌合的 APP 和 PS-1 ，能很好地模仿人类 AD 脑内的病理改变，已被平常操纵于 AD 、淀粉样斑块变成等闭联疾病的考虑 [20-21] 。水迷宫实行检测结果标明， 7 月龄 APP/PS1 双转基因幼鼠的研习与回顾才力已显着低于比较组，而 JuA 能剂量闭联性提升幼鼠的研习回顾才力，其高剂量组影响最佳，与阳性比较药多奈哌齐相当。 HE 、 Nissl 染色结果显示，模子幼鼠海马与皮层神经细胞数目删除、样子不正派，核皱缩显着，尼氏体数目删除，阐述神经元已显着受损；而经 JuA 调理后神经元与尼氏体数目显着填补，细胞方针较为分明，胞质丰盛，核固缩减轻，阐述 JuA 显着减轻了 AD 幼鼠脑机闭的病理毁伤。以上结果阐述 JuA 能有用维持脑机闭，明显改进 AD 幼鼠认知功效的困穷。
为了进一步商量 JuA 干涉 AD 的分子机造，调理已毕后分裂取比较组、模子组和 JuA 高剂量组幼鼠的海马机闭实行 RNA-Seq 剖析。 RNA-Seq 是近年生长起来的新一代高通量基因测序技艺，能全数神速地得到倾向机闭或器官一齐转录本序列音信，从全体水准考虑基因功效及布局，揭示特定的生物学历程以及疾病产生历程中的分子机造 [18-19] 。本考虑测序剖析结果显示，与比较组比力BOB半岛，模子组有 341 个区别表达基因；与模子组比力， JuA 高剂量组有 94 个区别基因，模子组的个别区别基因正在 JuA 干涉后表达趋向被逆转，阐述 JuA 可通过调控这些基因的表达调理 AD 。为真切 AD 病变及 JuA 调理后所涉及基因的生物学功效改变，对模子组筛选出的 341 个区别基因和 JuA 高剂量组的 94 个区别基因实行 GO 富集剖析，结果显示，模子组区别基因的功效闭键聚会正在细胞渗出医治、离子通道、肽激素连系与受体活性等；而 JuA 调理组的区别基因功效闭键富集正在离子转运、细胞骨架与胞质膜、核受体活性等方面。对上述区别基因实行 KEGG 信号通道富集剖析，结果显示，模子组涉及到钙离子信号通道、 cAMP 信号通道、 2 型糖尿病等；而 JuA 组涉及 2 型糖尿病、脂肪消化摄取、细胞黏附因子、 IL-17 和 TGF-β 信号通道等，阐述 JuA 抗 AD 的影响可以与调控代谢庞杂和炎症响应相闭。
AD 的发病机造万分杂乱，其产生生长每每与慢性炎症闭联疾病如动脉粥样硬化、肥胖 / 代谢归纳征和 2 型糖尿病等相闭，这些疾病的发作是竖立正在衰老历程中促炎细胞被激活惹起的全身慢性炎症根蒂之上 [6] 。炎症响应的激活可导致血脑屏蔽通透性填补，幼胶质细胞和星形胶质细胞活化，触发淀粉样卵白斑块和神经原纤维缠结的变成，从而导致突触损失和神经退行性病变 [6,22-23] 。目前闭于血清各炎症因子与 AD 发病之间的闭连尚未万分真切，但已有考虑报道，多种促炎因子如 IL-1 、 IL-2 、 IL-6 、 IL-8 、 IL-17 、肿瘤坏死因子 -α 等与抗炎因子 IL-4 、 IL-10 、 IL-37 和 TGF-β1 等的表达失衡导致的慢性炎症，是惹起 AD 的苛重身分 [6] 。细胞黏附分子 L1 是表达于神经细胞质膜上的跨膜卵白，出席神经元之间的互相识别和贯串，正在 AD 海马机闭中能有用推动 Aβ 斑块的排除 [24] 。 TGF-β 超家族拥有神经维持功效，可从多方面拮抗 AD 病理更改，如 TGF-β1 能推动 Aβ 的排除、改进 Tau 病理、医治海马神经产生和突触可塑性等，从而改进 AD 认知功效 [25] 。
本考虑以模子组 vs 比较组、 JuA 高剂量组 vs 模子组协同医治的信号通道实行比对剖析，共筛选出 88 条通道，对排名前 10 的通道实行重点富集基因剖析，结果显示，与 JuA 调理 AD 闭联性最高的通道是青少年成熟期糖尿病、脂肪消化摄取、 2 型糖尿病、细胞黏附因子、 IL-17 信号通道和 TGF-β 信号通道，阐述 JuA 可通过调控代谢庞杂和炎症响应减轻 AD 病理毁伤，遏抑 AD 的产生生长。
糖尿病是推动 AD 产生生长的紧张身分之一。糖尿病患者脑葡萄糖代谢分表、胰岛素屈服、晚期糖基化终末产品和炎性幼体等加剧了脑内免疫炎症响应和氧化应激毁伤，推动了淀粉样斑块和神经原纤维缠结的变成，从而加重了AD 的病理毁伤[26-27] ；鉴于糖尿病与AD 之间的干系和目前缺乏有用调理AD 的药物，越来越多的考虑聚会于用抗糖尿病药物把握或逆转AD[28] ，个中新型降糖药Gck 激昂剂的研倡始了平常提防。Gck 是葡萄糖代谢历程中第1 个限速酶，能敏捷识别葡萄糖水准更改，合时调控胰岛素及胰高血糖素渗出并推动葡萄糖磷酸化，从而连结葡萄糖的稳态，故Gck 激昂剂希望成为全新抗2 型糖尿病药物，并对AD 的防治带来新的欲望[29-30] 。本考虑区别基因剖析结果显示，JuA 干涉了AD 幼鼠脑内Gck 、Irak3 和Msln 等基因，个中Gck 正在模子组幼鼠脑内明显低落，而JuA 调理后Gck 表达显着升高，阐述Gck 可以是JuA 调理AD 的苛重靶点之一；正在与JuA 调理AD 闭联性最高的前10 条通道中，Gck 基因高频闪现，阐述上调葡萄糖激酶活性撑持葡萄糖稳态可以是JuA 阐明抗AD 影响的机造之一；经qRT-PCR 与Western blotting 实行验证，标明JuA 组Gck mRNA 与卵白表达均明显高于模子组，结果与RNA-Seq 剖析划一。其他区别基因未正在这些通道中高频闪现，且与AD 的闭联性目前尚不万分知晓，故有待于下一步实行验证。
综上， JuA 能显着减轻AD 幼鼠脑机闭病理毁伤，提升幼鼠研习和回顾才力，其影响机造可以与调控炎症响应与代谢庞杂相闭，个中上调Gck mRNA 与卵白表达，撑持血糖均衡可以是JuA 调理AD 的苛重机造之一。
来 源：王 翠，肖洪贺，闻彩名，赵宇萌，田 雨，刘 月，杨静娴．基于转录组学商量酸枣仁皂苷A改进阿尔茨海默病幼鼠认知功效困穷的机造 [J]. 中草药, 2023, 54(24): 8094-8104.
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